杭书扬 杨留枝,2,3 史苗苗,2,3 闫溢哲,2,3 刘延奇，2，3
(1. 郑州轻工业大学食品与生物工程学院，河南 郑州 450001；
2. 食品生产与安全河南省协同创新中心，河南 郑州 450001；
3. 河南省冷链食品质量安全控制重点实验室，河南 郑州 450001)
山药是薯蓣属的一种药食两用植物[1]，富含多糖、类黄酮、多酚、尿囊素和其他活性成分[2]。在亚洲，尤其是日本和中国，山药被研磨成粉制成面条食用[3]，传统的食用过程中所产生的山药皮是其主要残留物，约占山药总重量的10%～20%[4]。已有研究表明，山药皮生物活性物质含量(尿囊素、黄酮、多酚等)均高于其果肉[5]，在保健食品开发利用方面具有巨大的潜力[6]。
多糖是由单糖缩合聚合物组成，广泛存在于动物、植物和微生物中。近年来，有关山药中非淀粉多糖的提取、化学结构及生物活性的研究较多[7]，植物源的非淀粉多糖已成为一类重要的生物活性天然产物，在自由基清除剂中发挥重要作用，并逐渐成为一类新型的有效抗氧化剂[8]。山药多糖是山药的主要活性成分，主要由甘露糖、木糖、阿拉伯糖、葡萄糖和半乳糖等单糖组成，是一种具有免疫活性的植物多糖[9]。
目前，对山药多糖的研究主要集中于其果肉多糖，有关山药皮及其抗氧化活性的研究较少。研究拟以山药皮和经乙醇提取多酚、黄酮的山药皮残渣为原料，进行多糖提取，得山药皮多糖(P1)和山药皮残渣多糖(P2)，同时对P1和P2的单糖组成、结构特征及抗氧化活性进行分析，以期为研发新型天然抗氧化产品，增加山药皮经济效益提供依据。
1.1 材料
新鲜铁棍山药：市售；
葡萄糖标准品、无水乙醇、溴化钾、硝酸钠、叠氮化钠、抗坏血酸、DPPH、复合磷酸盐、铁氰化钾、三氯乙酸、氯化铁、硫酸亚铁、过氧化氢、水杨酸等：分析纯，天津市富宇精细化工有限公司。
1.2 仪器与设备
循环水式多用真空泵：SHB-Ⅲ型，郑州长城科工贸有限公司；
色差仪：CR400型，日本美能达公司；
高速离心机：LG10-2.4A型，北京医用离心机厂；
扫描电子显微镜：TESCAN MIRA4型，日本Rili公司；
红外光谱仪：Bruker TENSOR27型，德国布鲁克公司；
X-射线衍射仪：Bruker D8型，德国布鲁克公司；
差式扫描量热仪：DSC Q20型，美国TA公司；
综合热分析仪：TG/DTA-A型，德国耐驰公司；
多角度激光散射凝胶渗透色谱：DAWNHELEOS Ⅱ型，美国怀雅特公司。
1.3 方法
1.3.1 提取工艺 山药皮和山药皮残渣磨粉，过80目筛网，分别称取两种粉末10 g，加入200 mL去离子水，磁力搅拌混匀，50 ℃萃取3 h，过滤，重复3次，合并上清液并浓缩至一定体积。自然冷却后，加入4倍体积的无水乙醇，静置24 h，离心，沉淀加少量去离子水溶解，冷冻干燥得粗多糖。
将两种粗多糖按m粉末∶V水为1∶10 (g/mL)溶于去离子水，采用Sevage法去除蛋白质2次(V多糖溶液∶V氯仿∶V正丁醇为15∶3∶1)。将多糖溶液离心，收集上层水溶液，得到不含蛋白质的多糖溶液，透析，减压浓缩，加入无水乙醇沉淀24 h，离心，沉淀于去离子水中复溶，冻干，得精制多糖P1和P2[10]。
1.3.2 多糖含量及颜色测定
(1) 多糖含量：采用苯酚硫酸法[11]。
(2) 颜色：采用色差仪。
1.3.3 单糖组成 参考文献[12]。
1.3.4 扫描电镜观察(SEM) 用胶带粘取干燥的多糖均匀涂开，并吹去表面多余的样品粉末，然后在真空环境中进行喷金，加速电压3.0 kV，选择合适的放大倍数进行拍摄[13]。
1.3.5 X-射线衍射测试(XRD) 在工作电压30 kV，电流20 mA，衍射角(2θ)扫描范围10°～50°下，进行XRD谱图扫描[14]。
1.3.6 紫外扫描测试(UV) 称取多糖样品5 mg，加入5 mL 去离子水配成1 mg/mL样品溶液，扫描范围200～400 nm，去离子水作空白对照[15]。
1.3.7 傅里叶红外光谱测试(FTIR) 参考文献[16]，分辨率为0.4 cm-1，光谱范围为400～4 000 cm-1。
1.3.8 刚果红试验 参考文献[17]，使用紫外分光光度计扫描400～700 nm范围内的最大吸收波长(λmax)。
1.3.9 同步热重分析(TG) 根据文献[18]，升温范围为50～600 ℃，升温速率10 ℃/min，负载气体为N2。
1.3.10 分子量测定 采用多角度激光散射凝胶渗透色谱法，将样品溶于去离子水中，配制成质量分数为0.3%的水溶液，流动相为50 mmol/L NaNO3和0.02% NaN3的混合溶液，待测样品及流动相经超声、抽滤(0.2 μm抽滤膜)后进行分析测定[19]。
1.3.11 抗氧化能力测定
(1) DPPH自由基清除率：参考文献[20]并修改。取2 mL多糖溶液与2 mL 0.1 mmol/L的DPPH-乙醇溶液混匀，37 ℃避光反应30 min，以维生素C作阳性对照，测定517 nm处吸光度，按式(1)计算DPPH自由基清除率。
(1)
式中：
C1——DPPH自由基清除率，%；
A0——去离子水代替样品的吸光度；
Al——样品溶液吸光度；
A2——无水乙醇代替DPPH的吸光度。
(2) 羟自由基清除率：参考文献[21]并修改。向试管中分别加入1 mL不同浓度的多糖溶液、硫酸亚铁溶液(6 mmol/L)和过氧化氢溶液(6 mmol/L)，混匀，静置10 min，加入1 mL水杨酸，轻轻摇动并保持30 min，测定510 nm处吸光度，并按式(2)计算羟自由基清除率。
(2)
式中：
C2——羟自由基清除率，%；
A0——对照组(无样品)吸光度；
Al——试验组(无水)吸光度；
A2——空白组(不含水杨酸)吸光度。
(3) 还原力：参考文献[22]。
(4) 总抗氧化能力：参考文献[23]。
1.3.12 数据分析 各试验重复3次，采用Excel整理数据，IBM SPSS Statistics 22.0软件程序Duncan检验法进行显著性分析(P<0.05)，采用Origin 2021软件作图。
2.1 多糖含量及颜色
经测定，P1、P2得率分别为(2.6±0.2)%和(2.4±0.1)%，经苯酚硫酸法检测得P2的多糖含量(33.5%)约为P1(17.8%)的两倍。经色差仪检测，P2的L*(70.33)值大于P1(64.09)的，而其b*值(11.72)小于P1(13.93)的，说明P2的颜色比P1白，可能是因为山药皮残渣在提取黄酮、多酚过程中被乙醇脱去了部分颜色。
2.2 单糖组成
由表1可知，两种多糖均检测出5种单糖成分(阿拉伯糖、木糖、甘露糖、葡萄糖及半乳糖)。P1中主要的单糖为甘露糖、葡萄糖及半乳糖，占比分别为(32.61±0.68)%，(33.46±0.59)%，(22.19±0.87)%，此外还含有少量的阿拉伯糖[(7.70±0.47)%]和木糖[(4.10±0.28)%]。而P1的单糖主要为甘露糖和葡萄糖[(13.80±0.52)%]，其中甘露糖含量最高，约占P2总单糖的(70.61±0.95)%，阿拉伯糖、木糖和半乳糖的含量相对较少，分别为(5.55±0.25)%，(6.44±0.18)%，(3.72±0.23)%。二者单糖成分差异很大，可能是提取山药皮多酚、黄酮时，提取溶液对P2的单糖组成有一定的影响，需后续进一步探究。
表1 P1、P2的单糖组成†
2.3 SEM结果
由图1可知，P1、P2均为疏松、多孔状结构，P2表面有着密集细小的孔洞，可能是因为山药皮残渣在乙醇提取多酚、黄酮过程中，多糖与多酚之间作用力消失所造成的。多糖表观结构的不同可能造成其分子量差异[24]，P1、P2表面样貌的差异也可能导致两种样品分子量的差异。
图1 扫描电子显微镜图Figure 1 Scanning electron microscope images (×1 000)
2.4 XRD结果
由图2可知，两种多糖在15°，20°，32°附近有较强的吸收峰，P2和P1有着相同的峰型，但P2各吸收峰强度大于P1，表明山药皮多糖中不仅存在微晶结构，还存在晶体和非晶结构共存的多晶系统。
图2 P1、P2的X射线衍射图谱Figure 2 X-ray diffraction patterns of P1 and P2
2.5 紫外扫描结果
由图3可知，两种多糖在260～280 nm 处均未检测到紫外吸收峰，说明多糖中不存在蛋白结构，表明经Sevage试剂处理后，两种多糖样品均不含蛋白质。
图3 P1、P2的紫外光谱图Figure 3 Ultraviolet spectra of P1 and P2
2.6 FT-IR图谱分析
由图4可知，P2峰型比P1的更加明确，特征官能团更为突出，进一步表明P2的多糖含量与品质较P1有一定程度的提高。3 402 cm-1处有较宽、较强的谱带，该谱带归属于—OH的伸缩振动；
2 935 cm-1处弱峰属于C—H 反对称拉伸振动；
1 625 cm-1处出现不对称的拉伸峰，表明多糖中存在羧基，这与多糖中的水有关[25]；
1 413 cm-1处为C—H剪切振动的特征吸收峰；
1 200～1 000 cm-1的波段被指定为C—O—C键和糖苷桥[26]的价振动，1 154 cm-1处为O—H剪切振动峰值；
1 024 cm-1处为C—O—C拉伸振动峰值[27]。
图4 P1、P2的红外光谱图Figure 4 Infrared spectra of P1 and P2
2.7 刚果红试验结果
具有三螺旋结构的多糖在碱性条件下能与刚果红形成络合物，其最大吸收波长(λmax)随碱溶液浓度的增加而红移，分子间和分子内氢键断裂，并发生了从三螺旋到单螺旋的构象转变[28]。由图5可知，与对照组相比，多糖溶液的λmax红移，说明P1、P2均存在三螺旋结构。此外，随着NaOH浓度的增加，各多糖的λmax下降。
图5 不同浓度NaOH下刚果红多糖混合物的最大吸收波长
2.8 TG结果
由图6可知，两种多糖具有相似的失重曲线形态，其失重过程可分为3个阶段：① 30～200 ℃阶段，样品重量略有下降，可能是多糖失去了束缚水[29]；
② 200～480 ℃阶段，多糖快速失重，其重量开始急剧下降，可能是由多糖的解聚和分解引起的[30]，多糖的大部分重量损失发生在该区域；
③ 400～600 ℃阶段，由于多糖完全分解，样品的失重变得缓慢。P1、P2最终重量分别降至其初始重量的61.11%，51.04%，说明P2的热稳定性不如P1。
图6 P1、P2的TG 图Figure 6 TG diagrams of P1 and P2
2.9 分子量分析
多糖的分子量(Mw)是影响水溶液中多糖构型和形态的主要因素之一，并参与蛋白质—碳水化合物相互作用，影响其生物活性。由图7可知，多糖P1、P2分别在横坐标为4.57，3.54时出峰，其重均分子量分别为37 153.52，3 467.37。
图7 P1、P2的分子量分布图Figure 7 Molecular weight distribution of P1 and P2
2.10 抗氧化试验
2.10.1 DPPH自由基清除率 由图8可知，当样品质量浓度为0.2～1.0 mg/mL时，DPPH自由基清除能力与多糖、维生素C质量浓度呈正相关，P2各浓度下的清除率均显著强于P1，但是P1、P2的清除率均显著低于维生素C。P1、P2和维生素C的IC50值分别为0.964，0.586，0.016 mg/mL，DPPH自由基清除率强弱顺序为维生素C>P2>P1，说明多糖具有一定的DPPH自由基清除率，与林军等[30]的研究结论一致。
小写字母不同表示差异显著(P<0.05)
2.10.2 羟自由基清除率 由图9可知，当样品质量浓度为0.2～1.0 mg/mL时，P1、P2和维生素C的羟自由基清除能力随溶液质量浓度的增大而增强，与张秋红[31]的研究结论一致。P1、P2和维生素C的IC50值分别为0.962，0.711，0.450 mg/mL，表明P2的羟自由基清除能力强于P1，但不如维生素C。
小写字母不同表示差异显著(P<0.05)
2.10.3 还原力与总抗氧化能力 由图10和图11可知，两种多糖在各浓度水平下的还原力(抗氧化能力)均不如维生素C，在试验质量浓度范围内，随着质量浓度的增加，样品的还原力(抗氧化能力)随之显著增强，当样品质量浓度为1 mg/mL时，P2的还原力(抗氧化能力)显著强于P1。
小写字母不同表示差异显著(P<0.05)
小写字母不同表示差异显著(P<0.05)
以山药皮和山药皮残渣为原料进行多糖提取，并对其提取物的结构和抗氧化性进行分析。结果表明，山药皮残渣中多糖提取得率与山药皮中相差不大，且山药皮残渣多糖较山药皮多糖有着糖含量高、色泽亮度强、比表面积大、重均分子量小、抗氧化能力强等优势。虽然山药皮残渣多糖具有良好的抗氧化能力，但是未能确定其发挥抗氧化活性成分的关键物质，后续可通过分离纯化技术来进一步研究。
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