黄晓珊，王亚琴，卢佳佳，曾俊棠，黄烁，范宇梦，吕立铭，李大炜
（ 惠州卫生职业技术学院，广东惠州，516025）
新型冠状病毒肺炎的爆发使人们逐渐认识到小型密闭空间的空气质量对健康的影响。而评估空间空气质量的重要指标之一是微生物含量［1］。为了减少微生物对空气质量的影响，现多采用化学消毒、换气或过滤的方法，但这些方法往往对人体不够友好或效率低下［2-4］。在中国传统医学中，熏香法是最常见的空气抑菌消毒技术之一［5，6］。现代研究表明，许多中药材中包含的挥发性成分具有良好的抑制或杀灭空气浮游菌的作用［7-11］。然而，单一种类的中药挥发油的抑菌作用范围较窄，难以对复杂的微生物群产生良好的抑菌效果，需通过复配起到协同增效和拓宽抑菌谱的作用［12，13］。挥发油气相接触体外抑菌优于分散在培养基中固相接触的效果［14-16］，原因可能是液相和固相在应用时都要进行乳化并包裹上水膜才能分散，而气相亲脂性分子更容易穿过细胞壁，通过影响膜脂和膜蛋白破坏细胞膜而发挥作用［17，18］。中药空气抑菌消毒法具有纯天然、无毒、安全等优势，可以实现安全的连续性抑菌消毒。
1.1 材料与仪器
耗材：丁香、艾叶、香茅挥发油（广州化工）；
平板计数琼脂培养基（广东环凯微生物科技有限公司）；
φ7cm 快速滤纸、φ9cm 硼硅玻璃培养皿均采购自国内供应商。
主要仪器设备：DSX-280B 立式灭菌锅（上海申安医疗器械厂）；
SW-CJ-2F 超净工作台（苏州净化设备有限公司）；
ZRG-1000C-LC 智能人工气候箱（上海丙林电子科技有限公司）；
P-C20L/H 超纯水机（中壮纯净水科技有限公司）。
1.2 复配抑菌剂试验方法
采用最优混料设计（D-Optimal）进行配方筛选［19-21］。对前期研究所得的3 种高效抑菌的植物挥发油进行复配。利用Design-Expert 12.0 中自带的Optimal（custom）进行试验设计，随机组成16 个模拟配方组合（运行序列），见表1。以一定量挥发油处理后的平板孵育菌落数量作为考察指标，对3 种植物挥发油复配比例与孵育菌落数拟合模型方程，最终得到复配抑菌剂的最佳配方组合。
表1 最优混料设计组合及孵育菌落数实测值和预测值
采样：采用平板暴露法，参考《医院消毒卫生标准》（GB 15982—2012）执行。2022 年5—6 月，采用平板暴露法在校内饭堂离地75cm 的桌面上收集落菌，每次采样的采样点不低于3 处。运行序列不重复的有11 组，按每处采样点平行取样不低于11 个，每个采样点之间及与墙壁、立柱间隔4 米以上。在中午就餐高峰期过后，商铺打烊期间采样，单次采样时长30min。
抑菌孵育：参考抑菌效果评价试验进行孵育。将300μl 的运行序列配方挥发油滴加在灭菌滤纸上，并放置在培养皿内底面，然后将之前的采样平板倒扣其上，用封口膜封闭并标注记号。在37℃、湿度95%的培养箱内倒置孵育48 小时。孵育后，将平板置黑色背景上拍照并计数。
1.3 抑菌效能验证
实验室验证：根据1.2 方法得出的挥发油复配比例与孵育菌落数拟合模型方程，优选3 组配方比例。按1.2 试验方法采样、抑菌孵育、计数重复试验，对3组配方进行抑菌效果验证试验，选取最优配方。
现场验证：选取2 间28m2宿舍，采样前清空人员并密闭宿舍1h。对角离墙≥1m、离地75cm～80cm 三点采样，采样时长30min。以通用精油雾化器熏蒸最佳配方挥发油3mL/间，熏蒸完毕30min 后，按前述方法采样。培养箱内，在37℃、湿度95%的条件下孵育48h，三个采样点合并计数。重复4 次。
1.4 统计分析
所有分析测试均采用多次平行处理，每项测试所得取均值计入。采用IBM SPSS Statistics 24.0 对试验数据进行处理，同时分析前对各数据进行Shapiro-Wilk正态性检验。计量资料符合正态分布，采用均值±标准差（x-±s）描述，样本数据组间比较采用ANOVA 方差分析。计量资料不符合正态分布，采用中位数和四分位间距M（P25～P75）描述，样本数据组间比较采用Kruskal Wallis H 和Mann-Whitney U 秩和检验。显著性水平p＜0.05。
2.1 复配抑菌剂优选结果
试验最终获得样品312 份，因16 组运行序列配方有重复，所以实际按11 组配方开展试验，使用样品286 份。由表1 看出，3 种挥发油单独作为抑菌剂使用时，孵育菌落数在17.47～53.57 个之间；
若组合使用，8 个组合孵育菌落数在6.10～37.23 个之间，这显示出复配抑菌剂具有明显的增效作用，见图1。
图1 11 组运行序列挥发油配方抑菌孵育菌落数的实测值
根据表1 所得的运行序列组合孵育菌落数实测值和Design-Expert 12.0 给出的预期值进行二次多项回归拟合，得到孵育菌落数（Y）与各挥发油配方比例之间的拟合方程：Y=17.60A+53.01B+36.76C-1 0 6.1 1 A B-8 4.8 7 A C-6 3.9 3 B C+ 7 8 2.7 9 A2B C-1178.89AB2C+413.15ABC2，其中A、B、C 分别代表丁香挥发油、艾叶挥发油、香茅挥发油的比例。通过对模型进行方差分析（见表2），发现二项式模型达到极显著水平（p＜0.01），判定系数R2=0.9893。校正后的判定系数，这表明模型方程很好地拟合了孵育菌落数与各挥发油在复配抑菌剂最终配方中的比例关系。从各因素的交互作用差异性分析可看出，仅AB、AC、BC 和AB2C 的交互作用对孵育菌落数量有显著影响（p＜0.05，下同），其中AB、AC 的交互作用有非常显著的影响（p＜0.01），其原因可能是丁香与艾叶、香茅挥发油结合对落菌的抑制存在强烈的互补增效作用。
表2 回归方程的方差与显著性差异
使用Design-Expert 12.0 的最优化功能，从随机组合开始进行最陡爬坡预测。从软件给出的最低孵育菌落数预测组合中优选三组组合，并提供预测值（见表3），这些值均落在拟合3D 曲面的最佳配方区域（见图2）。由表3 可看出，要想使孵育菌落数达到最小预测结果（5 个），复配抑菌剂中丁香、艾叶、香茅3 种挥发油的最佳比例分别为31.00%、51.20%、17.80%。
表3 最佳配方组合的抑菌孵育菌落数预测结果和实测结果
图2 三种挥发油配方与孵育菌落数拟合的3D 曲面
2.2 优选配方验证
通过实验室验证，实测三组配方孵育菌落数在0～18 个之间，均值见表3。对三组配方进行两两相互比较，序列72 的实测菌落数与序列76、69 存在显著性差异（p＜0.05），序列76、69 之间差异不显著（p＞0.05），见表4。最终选择爬坡序列69 配方，即以丁香、艾叶、香茅挥发油比例为45.2：41.6：13.2 制备空气抑菌剂。
表4 爬坡序列3 组配方抑菌孵育菌落数两两比较结果
选择宿舍进行现场实验验证，结果显示，空气抑菌剂熏蒸能显著减少空气浮游菌（见表5）。
表5 最佳配方空气抑菌剂的现场实验抑菌结果
古代空气抑菌技术多采用燃烧艾叶、苍术的方法熏蒸空气，然而燃烧产生的烟雾往往比较呛鼻，而且苍术的价格较高不利于开发使用。我们通过实验验证了中药抑菌挥发油复配后具有明显的增效作用，可以采用价格相对比较低廉易得的中药材，通过复配的方式达到抑菌效能显著增强的效果。丁香便是其中一种热门备选中药，其挥发油能对多种致病菌起到较强的杀灭作用，这与其所含的酚酸类化合物成分有密切关系［22，23］。本实验也证实了丁香对艾叶和香茅挥发油的抑菌效能有互补增强的作用。
在现实生活中，空气浮游菌是由多种致病菌和非致病菌构成的，其中致病菌主要分为细菌和真菌两大类。为了更接近生活应用场景，若采用标准菌株实验法需要众多菌种样本，且在抑菌试验完成后还需要评估每种菌种对抑菌剂效益价值权重，才能最终确定抑菌配方，操作比较复杂。因此，本研究采用现场实验法开展实验，其优点是能直接评估总体抑菌效能。但现场实验容易引入许多干扰因素，因此需要增加重复实验数量以减少偶然误差。同时，现场实验的场所有其相对固定的菌群谱，未来需要增加更多现场实验的场所重复验证最佳抑菌配方。此外，由于疫情的影响，宿舍的现场实验难以顺利开展，导致重复实验次数不足。
本研究未来将会与高校微生物科研机构合作，将抑菌孵育后仍然存活的少量菌种送检和鉴定。若是致病菌种，将结合数种常见的致病空气浮游菌进行配方验证，适当调整配方比例或者剂量，以开发出更有针对性的中药空气抑菌剂，拓宽产品的抑菌谱。
综上所述，随着我国居民卫生健康意识的提高，室内空气抑菌消毒用品需求量激增，消费者已不再满足单纯的化学类消毒产品。中药空气抑菌剂作为一种新型的天然抗菌剂，市场需求将会越来越大。本研究的产品抑菌效果明显，气味芳香，易于被人们接受，具有广泛的应用前景和推广价值。
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