唐保山, 刘义稳, 和 锐, 邹 勇, 谢山宇, 张 弘*
(1.中国林业科学研究院 高原林业研究所;国家林业和草原局资源昆虫培育与利用重点实验室,云南 昆明 650233; 2.五峰赤诚生物科技股份有限公司,湖北 宜昌 443413;3.五峰土家族自治县公共检验检测中心,湖北 宜昌 443413)
五倍子,享有中国五倍子的声誉,是瘿绵蚜科蚜虫寄生在盐肤木、青麸杨等寄主植物的树叶或叶柄上形成的虫瘿[1-2]。我国五倍子年产量1.2～1.3万吨,占世界总产量95%以上,是我国的特色农林资源[3-4]。因五倍子收敛、止血,为我国传统中药材,而其提取物单宁酸及其加工衍生物没食子酸丙酯则为常用食品添加剂[5]。五倍子主要由单宁酸和没食子酸组成,此外还含有少量脂肪、蜡质、淀粉等。水分、单宁酸和没食子酸的含量直接影响五倍子质量,尤其是水分含量过大,五倍子易产生霉变[6-7]。传统测试方法多采用中华人民共和国林业行业标准进行测定,该方法经典、可靠,但分析时间长、样品损耗量大,且无法同时测定,难以满足大批量样本分析,在很大程度上妨碍了行业标准在实际中的应用[8-9]。在工业快速发展的今天,研发一种就地、快速、准确的检测方法对于五倍子的质量控制和市场监管具有重要意义。
1.1 原料、试剂与仪器
五倍子样本130份(湖北省32、重庆市15、湖南省20、云南省14、贵州省21、陕西省14、四川省14),由五峰赤诚生物科技有限公司收集提供;为保证测试样品的均匀性,将收集到的130份五倍子样本经高速粉碎机粉碎后,取粒径≤0.38 mm粉末备用。铬皮粉,上海远慕生物科技有限公司;没食子酸标准品,美仑生物技术有限公司;单宁酸标准品,中国林科院林产化学工业研究所。
MPA傅里叶变换近红外光谱仪,德国布鲁克科技有限公司;Cary100紫外分光光度计,安捷伦科技有限公司;VOS-300VD真空干燥箱,倍捷科技有限公司;FW-100高速万能粉碎机,北京中兴伟业仪器有限公司。
1.2 五倍子中水分、单宁酸和没食子酸含量的测定
五倍子样本中水分参照LY/T 1302—2016[15]测定。称取五倍子粉末原料8 g,用滤纸包裹后放入索氏提取器中,用800 mL去离子水在回流条件下抽提5 h,结束后转入1 000 mL容量瓶中,待液体温度降至室温时,用去离子水稀释到刻度,摇匀备用。单宁酸含量以铬皮粉吸附法测定[15],铬皮粉吸附后的溶液经滤纸过滤后参照LY/T 1642—2005[16]测定没食子酸含量。每个样品测定3组平行数据,以平均值作为样品测定值。
1.3 近红外光谱数据采集
开机预热30 min,保证仪器稳定;试验环境温度25 ℃;样品采集时,设置仪器参数:扫描时仪器分辨率4 cm-1,扫描次数64次,光谱波数范围12 500～4 000 cm-1;以空IN312-SH型样品杯(Φ=97 mm)作为参比样品进行光谱采集,样品量为样品杯体积的2/3,并用250 g砝码压住粉末样品以保证样品紧实度的一致性,光源从样品杯底部照射样品[17-18]。为确保样品采集的均匀性,采用旋转积分球漫反射光谱模式,每个五倍子样品重复采集5次,取其平均光谱作为样品代表性光谱。
1.4 近红外模型的建立
1.4.1样品集的划分 把收集的五倍子样本按约3∶1的比例随机划分为校正集和验证集,校正集用来建立水分、单宁酸和没食子酸的近红外模型,验证集用来验证模型的可靠性,此时应注意组分的最大值和最小值应在校正集中。
1.4.2光谱的预处理方法 近红外光谱的扫描测量易被光散射效应、仪器稳定性、试验环境等因素影响,需要对原始光谱进行预处理消除噪声,以提高模型的准确性。本研究采用的预处理方法有无光谱处理(None)、一阶导数(FD)、二阶导数(SD)、矢量归一化(VN)、消除常量偏移量(ECO)、最小-最大归一化(M-MN)、减去一条直线(ML)、多元散射校正(MSC)[19-21],选取1种或2种进行复合光谱预处理,最终选出最佳光谱预处理方法。
1.4.3光谱的最优波段 PLS虽然可以处理全谱信息,但这些信息中包含了过多的冗余信息。因此,需要找到能充分反映出样品中各指标组分的最佳建模波段来改善模型性能,提高计算速度。采用组合区间偏最小二乘法(SIPLS)筛选五倍子中水分、单宁酸和没食子酸的特征波段[22]。当交叉验证均方根误差(RMSECV)最小时,对应的组合区间就是该模型的最优特征波段。
1.4.4主因子数 采用PLS建立定量模型时,采用内部交互验证法筛选主因子数,主因子数的大小会影响模型预测能力。通常主因子数太小,模型输入数据中与待测组分关联的信息利用不充分;主因子数值太大,输入数据中与待测组分无关的信息也被引入模型中。以RMSECV作为主因子数的选择依据,对应最小的RMSECV为最佳主因子数[23]。
1.5 模型质量评价
2.1 五倍子近红外原始光谱
由图1可知,五倍子近红外图谱趋势大致相同,但不同样本的吸收峰强度不同,表现出不同的反射率,说明各样品组分含量不同。结果表明试验的五倍子近红外光谱数据符合建立近红外定量分析模型的要求。
图1 五倍子近红外原始光谱Fig.1 Near infrared original spectra of Chinese gallnut
2.2 光谱预处理方法的选择
表1 预处理方法的选择
a.水分moisture(FD+MSC); b.单宁酸tannic acid(FD); c.没食子酸gallic acid(FD+ML)
2.3 最优波段选择
表2 特征波段筛选
2.4 主因子数选择
由图3可知,水分、单宁酸和没食子酸的主因子数分别为9、 10和5时,对应的RMSECV最小,说明在该主因子数下,该模型的误差最小。
a.水分moisture; b.单宁酸tannic acid; c.没食子酸gallic acid
2.5 校正集和验证集的划分
校正集和验证集中水分、单宁酸和没食子酸的质量分数范围、平均值和标准差见表3。由表3可知,所选样品中各组分质量分数范围较宽,代表性较强,且最小值和最大值都在校正集内,符合建立模型样品选择的原则。
表3 校正集和验证集划分
2.6 近红外模型建立与验证
为使数据更好拟合,反复进行内部交叉验证剔除异常值。水分、单宁酸和没食子酸的校正集剔除异常值数量分别为0、 4、 1,验证集剔除异常值数量分别为0、 1、 3。水分、单宁酸和没食子酸的校正集、验证集的预测值和真实值的关系如图4所示。
校正集corrected sets: a.水分moisture; b.单宁酸tannic acid; c.没食子酸gallic acid
表4 五倍子中水分、单宁酸和没食子酸的模型回归方程