陈敬宜，于 淼，张金洋，樊 堃，杨桂君，葛 铭，张瑞莉*
(1.东北农业大学动物医学学院，哈尔滨 150030；
2.黑龙江省实验动物与比较医学重点实验室，哈尔滨 150030)
镉(cadmium，Cd)是自然环境中毒性最大的重金属污染物之一，主要存在于硫镉矿、锌矿中，因其良好的物理性质，在冶金、电镀、涂料和充电电池等生产中得到广泛应用。随着自然环境变化、工农业迅速发展以及人类活动的频繁，镉对土壤、水源、空气的污染越来越明显，土壤或水域中的镉不断被农作物或水生生物吸收蓄积，经过食物链层层传递，造成镉在多种生物体内富集[1-2]。镉是人和动物体非必需的金属元素，由于其生物半衰期长，从体内排出的速率十分缓慢，容易在体内蓄积，对肝、肾、睾丸、肺、骨、心、脾和脑等多种器官组织产生严重损伤，甚至还具有遗传毒性和致癌性[3-6]。随着镉对自然环境污染和对人和动物健康威胁越来越明显，探讨镉毒性机制逐渐被重视并成为生物学、医学和动物医学，特别是环境毒理学研究的重点和热点。
肝是镉蓄积和毒性损伤的主要靶器官，Cd2+可以通过Zn2+等运输载体、电压门控式Ca2+通道及Cd-金属硫蛋白结合态进入肝[7-8]。镉暴露的肝表现为肝细胞正常结构丧失、淤血、炎性细胞浸润、结缔组织增生，在功能上表现为肝重要酶类活性异常，导致肝功能紊乱[9-10]。氧化应激被认为是镉诱导肝毒性的重要机制[11]。本课题组前期研究发现，镉暴露鸡的肝组织内过氧化物蓄积，并伴有严重的炎性损伤[12]；
同时肝中谷胱甘肽过氧化物酶4(glutathione peroxidase 4，GPX4)表达显著降低。GPX4是铁死亡的关键调控蛋白，提示铁死亡机制参与到镉暴露鸡肝损伤过程。
铁死亡(ferroptosis)是一种铁依赖的脂质过氧化损伤引起的、全新的细胞死亡方式，近年来越来越受到关注[13]。铁死亡与坏死、凋亡、焦亡、自噬等有着明显的不同。在形态学方面，发生铁死亡的细胞主要表现为线粒体体积缩小、线粒体嵴减少或消失；
在生化方面，谷胱甘肽(glutathione，GSH)耗竭，GPX4表达降低，脂质氧化物不能经GPX4催化的谷胱甘肽还原反应代谢，继而二价铁离子以类似芬顿反应的方式氧化脂质，产生大量ROS，促使细胞发生铁死亡[14]。越来越多的证据表明，铁死亡在肝的多种病理过程中起着不可忽视的作用[15-18]。但到目前为止，未见有铁死亡参与镉致肝毒性损伤机制的研究报道。
如果铁死亡参与了镉致肝损伤过程，那么将会从全新的视角进一步揭示镉致肝组织乃至整个机体损伤机制。因此，本试验在建立镉暴露鸡肝损伤模型和鸡肝癌细胞染镉的细胞模型基础上，设立铁死亡激活剂和抑制剂对照，通过对铁死亡相关因子、线粒体动力学相关基因、炎症因子、氧化应激指标表达的检测及形态学观察，从多水平、多角度阐明铁死亡参与镉暴露鸡肝组织损伤机制。不但可丰富镉的毒理学理论内容，更为重要的是为镉暴露诊断、预后判断及拮抗药物的研发提供新的科学试验依据，同时也为比较医学和生物学研究提供有益的科学借鉴。
1.1 镉暴露鸡肝组织损伤与铁死亡相关性检测
1.1.1 试验动物及设计 选取30只1日龄海兰白蛋公鸡(购自哈尔滨市成高子孵化场)，预饲7 d，饲养期间鸡日粮根据中国鸡饲料标准配制。在7日龄时，将鸡随机均分为正常对照组(C组)和染镉组(Cd组)，每组15只。C组，饲喂基础日粮，与预饲期一致；
Cd组，在基础日粮中混入140 mg·kg-1氯化镉，试验周期60 d。试验期间观察鸡群精神状态、体况、体态等，并于染镉后20、40和60 d每组随机选取5只鸡心脏采血并安乐死，取肝组织，一部分置于10%福尔马林固定液，用于组织病理学检查；
一部分固定于2.5%戊二醛，用于超微病理变化观察；
其余部分置于-80 ℃冻存，用于镉与铁含量、肝功能酶活性、相关因子的实时荧光定量PCR法、Western blot法及ELISA法的检测。
1.1.2 肝组织内镉、铁含量检测 取1 g肝组织作为样本，采用电感耦合等离子体质谱法(ICP-MS)进行检测。
1.1.3 肝功能酶活性检测 取血清作为样本，根据ALT和AST试剂盒(购自南京建成生物工程研究所)说明书的具体操作步骤测定肝功能酶ALT和AST活性。
1.1.4 肝组织病理及超微病理变化观察 取部分肝组织固定于10%福尔马林固定液，制作石蜡切片，经HE染色后在光学显微镜下观察并拍照。另取一部分肝组织固定于2.5%戊二醛，经固定、脱水、浸透、包埋、聚合、修块、切片和染色后置于透射电子显微镜下观察并拍照。
1.1.5 肝组织炎症因子表达检测 采用实时荧光定量PCR法检测LOX、NF-κB、TNF-α、IL-6和IL-1β mRNA表达变化。分别提取各组肝组织总RNA，反转录合成cDNA，以cDNA为模板，使用SYBR Real-time PCR染料(购自北京宝日医生物技术有限公司)检测mRNA的表达。反应在Light Cycler 96 real-time PCR仪(Roche公司)上进行检测，反应体系为10 μL，反应程序为95 ℃预变性30 s；
95 ℃变性3 s、60 ℃退火30 s，共40个循环，退火延伸时检测荧光信号。以β-actin为内参，采用2-ΔΔCT法对检测结果进行分析。引物序列见表1。
表1 炎症因子基因引物序列
采用ELISA法检测肝组织TNF-α、IL-6、IL-1β含量变化。取10%肝组织匀浆，离心，取上清，根据TNF-α、IL-6、IL-1β ELISA试剂盒(购自上海酶联生物科技有限公司)说明书步骤检测肝组织TNF-α、IL-6、IL-1β含量。
1.1.6 肝组织氧化应激检测 取10%肝组织匀浆，离心，取上清，根据GSH-Px、SOD和MDA ELISA试剂盒(购自南京建成生物工程研究所)说明书检测肝组织内GSH-Px、SOD活性和MDA含量。
1.1.7 铁死亡相关因子表达检测 采用实时荧光定量PCR法检测铁代谢相关因子(FTH1和TFR)、铁死亡标志物(GPX4、ACSL4、PTGS2)mRNA表达，方法同“1.1.5”，引物序列见表2。
表2 铁死亡相关因子基因引物序列
采用Western blot法检测GPX4、ACSL4和PTGS2蛋白表达变化。分别取各组肝组织0.1 g，按比例加入RIPA组织裂解液，充分裂解，离心后取上清，SDS-PAGE，转印；
孵育一抗，一抗分别为1∶1 000稀释的兔抗鼠GPX4和ACSL4多克隆抗体(购于Affinity公司)、兔抗鼠PTGS2多克隆抗体和1∶1 000稀释的兔抗鼠β-actin单克隆抗体(购自万类生物科技有限公司)，4 ℃孵育过夜；
孵育二抗，二抗为1∶1 500稀释的HRP标记山羊抗兔IgG(购自万类生物科技有限公司)，37 ℃作用1 h；
使用ECL超敏发光液(购自上海天能科技有限公司)进行曝光，并用Image J软件进行灰度值分析。
1.1.8 肝组织线粒体融合相关因子表达检测 采用实时荧光定量PCR法检测OPA1、Mfn1和Mfn2 mRNA表达变化，方法同“1.1.5”，引物序列见表3。
表3 线粒体融合相关因子引物序列
1.2 铁死亡诱导镉暴露LMH细胞损伤检测
1.2.1 LMH细胞培养及分组 将LMH细胞(实验室保存)培养于含有10%胎牛血清(购自HyClone公司)的DMEM高糖培养液中，于37 ℃、5% CO2条件下培养。细胞分组及处理：Ⅰ组，加入2.5 μmol·L-1CdCl2；
Ⅱ 组，加入6.5 μmol·L-1铁死亡激活剂RSL3，孵育2 h；
Ⅲ组，加入2 μmol·L-1铁死亡抑制剂Ferrostatin-1，孵育2 h；
Ⅳ组，6.5 μmol·L-1RSL3孵育2 h后加入2.5 μmol·L-1CdCl2；
Ⅴ 组，2 μmol·L-1Ferrostatin-1孵育2 h后加入2.5 μmol·L-1CdCl2；
C组，不作处理。每组3个重复。在CdCl2孵育24 h后，收集细胞，用于后续检测。
1.2.2 LMH细胞活力检测 将细胞接种于96孔培养板中，37 ℃、5% CO2饱和湿度条件下按试验处理培养细胞相应时间后加入CCK-8溶液，孵育2 h后在酶联免疫检测仪上于A450 nm处测定吸光度。
1.2.3 LMH细胞炎症因子表达检测 采用实时荧光定量PCR法检测LOX、NF-κB、TNF-α、IL-6和IL-1β mRNA表达变化，方法参照“1.1.5”。
1.2.4 LMH铁死亡相关因子表达的检测 采用实时荧光定量PCR法检测GPX4、ACSL4、PTGS2、FTH1和TFRmRNA表达；
采用Western blot法检测GPX4、ACSL4和PTGS2蛋白表达变化。方法同“1.1.5”和“1.1.7”。
1.2.5 LMH细胞线粒体融合相关因子表达的检测 采用实时荧光定量PCR法检测OPA1、Mfn1和Mfn2 mRNA表达，方法同“1.1.5”和“1.1.8”。
1.3 数据统计与分析
使用SPSS 17.0软件进行数据分析，使用GraphPad Software Prism 6.01软件绘图。两组间的数据比较采用t检验方法，多组间的数据比较采用单因素方差分析(ANOVA)。各组值表示为“平均数±标准差(Mean±SD)”。P<0.05表示差异显著，P<0.01表示差异极显著，P<0.05被认为具有统计学意义。
2.1 临诊症状
C组鸡精神状态良好，生长情况正常。Cd组鸡被毛散乱、失去光泽，喜卧、无法直立，个体发育不良。
2.2 肝组织镉、铁含量
如图1所示，镉暴露后20、40、60 d，与C组相比，Cd组鸡肝组织镉、铁含量均极显著增加(P<0.01)。
“*”表示P<0.05，“**”表示P<0.01。下同
2.3 肝功能酶活性变化
如图2所示，镉暴露后20、40和60 d，鸡血清中ALT和AST的活性与对照组相比均极显著升高(P<0.01)。
图2 鸡血清ALT(A)、AST(B)活性变化
2.4 肝组织病理及超微病理变化
镉暴露组鸡肝细胞排列紊乱，胞浆内可见大小不等、数量不一的空泡，胞核染色变淡或溶解消失，细胞结构模糊，细胞之间界限不清；
窦状隙及门管区内红细胞数量增多，并可见有浆液、纤维素渗出及炎性细胞浸润。上述组织病理变化随着镉暴露时间延长而越来越显著。透射电镜下可见Cd组鸡肝细胞核核周间隙增大，大部分线粒体体积缩小，嵴减少；
内质网明显扩张。对照组鸡肝组织未见明显病理形态变化。
2.5 肝组织炎症因子的表达变化
如图4所示，在镉暴露后20、40、60 d的同一取样时间点，鸡肝组织NF-κB、TNF-α、IL-6的mRNA水平均较C组极显著升高(P<0.01)。镉暴露后20 d，与对照组比较，LOXmRNA的表达无显著差异(P>0.05)，IL-1β的mRNA水平显著升高(P<0.05)。镉暴露后40、60 d，与对照组比较，LOX和IL-1β的mRNA水平极显著升高(P<0.01)。鸡肝组织中TNF-α和IL-6的含量，与同一取样时间点的正常组比较，均极显著升高(P<0.01)。
A～E分别为鸡肝组织中LOX、NF-κB、TNF-α、IL-6和IL-1β mRNA表达变化；
F～G分别是鸡肝组织中TNF-α、IL-6和IL-1β的含量变化
镉暴露后20 d，与对照组相比IL-1β的含量无显著差异；
40、60 d时，IL-1β的含量均极显著升高(P<0.01)。
2.6 肝组织氧化应激水平变化
由图5可知，镉暴露后20、40和60 d，与同取样时间点的C组相比较，鸡肝组织中GSH-Px和SOD的活性均极显著降低(P<0.01)，MDA的含量极显著升高(P<0.01)。
A、B和C分别为鸡肝GSH-Px活性、SOD活性和MDA含量
2.7 肝组织铁代谢相关因子mRNA表达变化
图6显示，镉暴露后20 d，FTH1的mRNA 表达显著升高(P<0.05)，TFR的mRNA 表达极显著升高(P<0.01)；
镉暴露后40、60 d，与同一时间点对照组相比，FTH1和TFR的mRNA 表达极显著升高(P<0.01)。
A和B分别为鸡肝组织FTH1、TFR的mRNA 表达变化
2.8 肝组织铁死亡标志物表达变化
镉暴露后20 d，与C组相比，Cd组GPX4 mRNA水平极显著下降(P<0.01)，ACSL4 mRNA水平显著升高(P<0.05)，PTGS2 mRNA水平极显著上升(P<0.01)。镉暴露后40和60 d，Cd组相较于C组，GPX4 mRNA水平极显著下降(P<0.01)，ACSL4、PTGS2 mRNA水平极显著上升(P<0.01，图7A)。
镉暴露后20、40和60 d，Cd组与同一取样时间点对照组相比，GPX4的蛋白相对含量极显著下降(P<0.01)，ACSL4和PTGS2 的蛋白相对含量极显著升高(P<0.01，图7B)。
A.鸡肝组织铁死亡标志物mRNA表达变化；
B.鸡肝组织铁死亡标志物蛋白表达变化
2.9 肝组织线粒体融合相关因子表达变化
如图8所示，镉暴露后20 d，与同一取样时间点C组相比，OPA1和Mfn1 mRNA的表达无显著差异(P>0.05)，Mfn2的mRNA水平极显著下降(P<0.01)；
镉暴露后40 d，对比同一取样时间点C组，OPA1 mRNA的表达无显著差异(P>0.05)，Mfn1的mRNA表达显著下降(P<0.05)，Mfn2的mRNA表达极显著下降(P<0.01)。至镉暴露后60 d，OPA1、Mfn1和Mfn2的mRNA水平，与对照组相比均极显著下降(P<0.01)。
A、B和C分别为鸡肝组织中OPA1、Mfn1和Mfn2的mRNA表达变化
2.10 LMH细胞活力变化
在染镉细胞模型基础上，设立铁死亡激活剂和抑制剂对照，观察对LMH细胞活力变化。如图9所示，与C组相比，Ⅰ、Ⅱ和Ⅳ组细胞活力极显著降低(P<0.01)。Ⅴ组细胞活力，较Ⅰ组极显著升高(P<0.01)。
与C组相比，“*”表示P<0.05，“**”表示P<0.01；
与Ⅰ组相比，“#”表示P<0.05，“##”表示P<0.01。下同
2.11 LMH细胞炎症相关因子mRNA表达变化
如图10所示，与C组相比，Ⅰ和Ⅱ组细胞LOX、NF-κB、TNF-α、IL-6和IL-1β mRNA表达水平均极显著升高(P<0.01)。Ⅲ组中NF-κB和TNF-αmRNA表达水平较C组显著上升(P<0.05)，LOX、IL-6和IL-1β mRNA表达无显著差异(P>0.05)。Ⅴ组与经氯化镉处理的Ⅰ 组相比，LOX、NF-κB、TNF-α、IL-6和IL-1β mRNA表达水平均极显著降低(P<0.01)。
A、B、C、D和E分别为LOX、NF-κB、TNF-α、IL-6和IL-1β的mRNA表达变化
2.12 LMH细胞中铁代谢相关因子mRNA表达变化
如图11所示，与C组相比，Ⅰ、Ⅱ 和Ⅳ 组中FTH1和TFR的mRNA水平，极显著升高(P<0.01)。与Ⅰ 组相比，Ⅴ组中FTH1和TFR的mRNA水平极显著下降(P<0.01)。
A和B分别为LMH细胞中FTH1、TFR的mRNA 表达变化
2.13 LMH细胞铁死亡标志物表达变化
如图12所示，Ⅰ、Ⅱ 和Ⅳ 组中GPX4的mRNA水平，较C组极显著降低(P<0.01)，ACSL4和PTGS2的mRNA水平极显著升高(P<0.01)。与 Ⅰ 组相比，Ⅴ 组中GPX4的mRNA水平极显著升高(P<0.01)，ACSL4和PTGS2的mRNA水平极显著下降(P<0.01)。
A. LMH细胞铁死亡标志物mRNA表达变化；
B. LMH细胞铁死亡标志物蛋白相对表达变化
与C组相比，Ⅰ、Ⅱ 和Ⅳ组中GPX4的蛋白相对表达极显著降低(P<0.01)，ACSL4和PTGS2的蛋白相对表达极显著升高(P<0.01)。Ⅴ 组中，GPX4的蛋白相对表达，较 Ⅰ 组极显著升高(P<0.01)，ACSL4和PTGS2蛋白表达水平极显著下降(P<0.01)。
2.14 LMH细胞线粒体融合相关因子mRNA表达变化
如图13所示，与C组相比，Ⅰ 和 Ⅱ 组细胞中OPA1、Mfn1和Mfn2 mRNA表达水平极显著降低(P<0.01)。与 Ⅰ 组相比， Ⅴ 组OPA1、Mfn1和Mfn2 mRNA表达水平极显著上升(P<0.01)。
A、B和C分别为OPA1、Mfn1和Mfn2的mRNA表达变化
肝是镉最主要的靶器官。镉暴露造成斑马鱼肝组织核苷酸、氨基酸等代谢途径异常[19]；
引起大鼠肝细胞发生颗粒变性、脂肪变性和细胞坏死[20]；
在亚慢性镉中毒蛋鸡中，可以观察到肝组织充血，肝细胞严重变性、坏死，线粒体、内质网等膜性细胞器严重损伤[21]。本试验中，镉暴露组鸡肝内镉含量显著升高，血清中肝功能酶活性明显升高，肝细胞排列紊乱、空泡变性甚至坏死，肝淤血、浆液-纤维素性渗出及炎性细胞浸润，超微病理结构呈现肝细胞核周间隙变宽、内质网扩张、线粒体嵴断裂、减少，炎症因子LOX、NF-κB、TNF-α，IL-6 和IL-1β表达显著升高，表明镉暴露鸡肝组织发生了炎性损伤，该动物模型可用于镉致肝组织毒性机制的研究。
目前，氧化应激被认为是镉毒性作用的主要机制。Cd在体内蓄积破坏了氧化还原系统的动态平衡，诱导脂质过氧化反应，降低抗氧化能力，造成氧化损伤。MDA是脂质过氧化反应中产生的含量最高的单体醛类[22]；
GSH-Px和SOD是生物体抗氧化酶系统的主要成员。研究发现，镉暴露锦鲤肾中的MDA含量显著升高[23]。镉暴露也可引起小鼠肝组织SOD及GSH-Px活性降低，MDA含量升高[24]。本试验结果显示，镉暴露鸡肝组织GSH-Px和SOD的活性均极显著降低、MDA的含量极显著升高，表明镉暴露鸡肝组织损伤与氧化应激密切相关。
研究表明，氧化应激导致大量脂质过氧化物累积，为细胞发生铁死亡提供了条件[25]。那么，镉暴露鸡肝组织氧化应激损伤机制是否与铁死亡相关呢？为此，本试验对鸡肝内铁含量、铁代谢相关因子及铁死亡标志物进行了检测。结果显示，Cd组鸡肝中铁含量极显著升高，且铁含量的升高趋势与染镉时间具有明显的依赖性，表明镉暴露可引起鸡肝组织铁过载。生理条件下，铁含量在机体内维持着吸收与排出的动态平衡。其中，铁吸收主要依赖于TFR、铁的储存则主要是由FTH1介导的[26]。当机体发生铁过载，FTH1和TFR表达上调，来维持机体内铁含量稳定。结果显示，镉暴露鸡肝组织FTH1和TREmRNA相对转录水平显著升高。作为铁代谢的关键蛋白，FTH1和TRE的表达升高也是铁死亡发生的标志之一。试验同时发现，镉暴露鸡肝组织铁死亡标志物GPX4表达明显下调，GPX4下游的脂质过氧化物合成关键蛋白ACSL4和PTGS2的表达显著上调。上述结果表明镉暴露诱发了鸡肝细胞铁死亡。
线粒体体积变小、膜密度增加、嵴变少甚至消失是铁死亡区别于其他细胞死亡方式的主要形态特征[27]。细胞中调节线粒体形态与功能的动态过程是线粒体动力学，其中线粒体的融合关键因子为OPA1和Mfn1/2。OPA1蛋白可调节线粒体内膜的融合，维持线粒体嵴结构完整。Mfn1是线粒体融合蛋白，通过其结构域之间的间歇性相互作用，束缚两个相对的线粒体；
Mfn2参与线粒体和内质网之间的物理相互作用[28]。本试验中，镉暴露鸡肝组织OPA1、Mfn1和Mfn2 mRNA表达显著下降，肝细胞内大部分线粒体体积缩小、嵴断裂且数量减少，提示镉致肝细胞铁死亡破坏线粒体动力学动态平衡，引起肝损伤。
鸡肝癌细胞系(LMH)细胞是通过化学试剂诱导的、具有鸡肝细胞分化形态和生化特性的鸡肝癌细胞系，在保持鸡肝细胞分化大量表型特征的同时，具有连续传代的特征，适合作为体外试验的研究对象，常用于各种毒性物质对鸡肝细胞的毒性作用研究[29-30]。因此，本试验选用LMH细胞作为体外研究对象，建立铁死亡激活剂和抑制剂染镉细胞模型，进一步明确铁死亡在镉致肝损伤中的作用。铁死亡激活剂RSL3是含有亲电子的氯乙酰胺，可以和GPX4产生共价相互作用，从而导致GPX4不可逆的失活[31]；
铁死亡机制及Ferrostatin-1可以较为有效的抑制铁蛋白的沉积，从而抑制铁死亡的发生[32]。本研究发现，Cd与RSL3作用相同，均能引起GPX4表达下调、脂质过氧化物合成关键蛋白(ACSL4、PTGS2)表达上调、线粒体融合相关因子(OPA1、Mfn1和Mfn2)表达下调、炎症因子(LOX、NF-κB、TNF-α、IL-6、IL-1β)表达上调，表明Cd能够激活LMH细胞铁死亡，导致LMH细胞线粒体损伤和炎性损伤；
进一步研究结果显示，Ferrostatin-1可通过抑制铁死亡缓解Cd引起的LMH细胞线粒体损伤和炎性损伤。有研究发现，抑制线粒体中ROS的生成，可减轻炎症小体的生成[33]；
通过抑制线粒体分裂能够缓解烟草暴露诱导支气管上皮细胞的炎症反应[34]。上述研究结果提示镉通过诱导鸡肝细胞铁死亡导致线粒体结构损伤、功能障碍，促进肝组织炎性损伤。
总之，镉暴露造成镉大量蓄积于肝，导致肝氧化应激水平升高、铁代谢紊乱、大量脂质过氧化物累积，引发铁死亡，破坏线粒体的结构和功能，进而引起肝组织炎性损伤。
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