张昕淳，李荣玉，湛兴瑜，孙明明，姚小龙，李 明，廖 逊
(1.贵州大学 作物保护研究所，贵州 贵阳 550025；
2.贵州省山地农业病虫害重点实验室，贵州 贵阳 550025；
3.贵州大学 农学院，贵州 贵阳 550025)
吡唑醚菌酯别名唑菌胺脂，属于具吡唑结构的甲氧基丙稀酸脂类杀菌剂[1]，具有保护作用、治疗作用、内吸传导性和耐雨水冲刷性能；
持效期较长，应用范围较广[2]；
通过阻止细胞色素间的电子传递而抑制线粒体呼吸作用导致细胞死亡。其由德国巴斯夫公司于1993年开发，被广泛用于防治谷物、蔬菜、水果、药用植物等由子囊菌、担子菌、半知菌和卵菌等真菌病原体引起的各种病害[3]，如玉米大斑病[4]、小麦白粉病[5]、番茄颈腐病[6]、大白菜黑斑病[7]、黄瓜蔓枯病[8]、苹果炭疽病[9]、杨梅褐斑病[10]、草莓白粉病[11]等。
吡唑醚菌酯在我国主要登记作物有水稻、大豆、番茄、杨梅等40余种[12]，其残留情况受到密切关注。目前，针对探究吡唑醚菌酯在作物中的最大残留限量、残留半衰期、消解动态、在作物上的最终残留限量等的研究较多，但在蔬菜中的研究较少。为评估吡唑醚菌酯在不同类型作物中的残留，国内外学者建立了其在不同作物上的残留检测方法及消解动态试验[13-20]。如采用高效液相色谱法测定出吡唑醚菌酯在湖南、河北两地白菜中的半衰期分别为2.97 d和3.34 d，且一次施药7 d后符合安全要求[21]；
喷施吡唑醚菌酯4 d后检测出在花生壳与花生仁中的残留量低于检出限 0.05 mg/kg[22]；
吡唑醚菌酯在黄瓜中消解较快，长期膳食摄入风险较低[23]；
高效液相色谱-串联质谱法检测出吡唑醚菌酯在人参植株中的半衰期为0.2～8.4 d，且符合慢性膳食风险可接受水平[24]；
采用超高液相色谱-串联质谱法检测出吡唑醚菌酯在枇杷中的半衰期为9.5～12.8 d，且发现在施药2～3次间隔7 d及推荐安全间隔期为14 d的条件下，其残留符合安全要求[25]。
综上所述，吡唑醚菌酯被广泛地应用于防控多种病害，但其消解动态研究多集中在谷物、水果和中药材等作物上，在蔬菜上的消解动态和最终残留试验研究较少。我国2021年新颁布的《食品安全国家标准食品中农药最大残留限量》中规定了吡唑醚菌酯在蔬菜中的最大残留限量(GB2763—2021)，其值为0.02～5.00 mg/kg[26]。因此，为明确吡唑醚菌酯在不同蔬菜中的残留消解动态，保障蔬菜生产安全，本文采用高效液相色谱法QuECHES提取与高效液相色谱仪检测方法，研究吡唑醚菌酯在7种蔬菜中的残留消解动态，为其在7种蔬菜中安全合理地使用提供科学依据。
1.1 仪器和试剂
吡唑醚菌酯标准品(纯度99.5%，德国Dr.Ehrenstorfer Gmb H公司)；
25%吡唑醚菌酯悬浮剂(安徽辉隆集团银山药业有限责任公司)；
乙腈、无水硫酸镁、氯化钠等；
N-丙基乙二胺(PSA)。
高效液相色谱仪(DAD检测器，安捷伦1260)；
CK2000涡旋振荡仪(Thmorgan)；
AL104电子天平(梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司)；
4000 rpm/min离心机(Thermo Fisher)；
12 000 rpm/min离心机(Sigma)。
1.2 田间试验设计
试验参照《农作物中农药残留试验准则》[27]和《农药登记残留田间试验标准操作规程》[28]设计消解动态和最终残留试验。露地栽种蔬菜，每种蔬菜设4个处理，3次重复，1个对照。每个小区面积为30 m2，小区定苗150株左右，小区间设保护带，常规管理。待蔬菜长至出苗时，采用背负式喷雾器(3WBD-18B)喷雾施药。
1.2.1消解动态试验方法
在贵州大学农学院实验基地(露地)进行残留消解动态试验。每种蔬菜试验小区面积30 m2，重复3次；
分别在每种蔬菜叶片发育期施药，施药剂量45 mL/667 m2(制剂用量)，采用背负式喷雾器兑水喷雾，兑水量按每亩50 L，施药1次，于施药后2 h，1、2、3、5、7、10、14、21、28 d分别采集各种蔬菜样品。另设对照区，施用等量清水，并采集对照样品。所有样本在采集后2 h内运回实验室，并立即制成实验室样品于-20℃冷冻保存。
1.2.2最终残留试验方法
在贵州大学农学院实验基地(露地)进行最终残留试验。试验小区面积30 m2，重复3次；
分别以30 mL/667 m2(制剂用量)和45 mL/667 m2(制剂用量)兑水稀释使用，兑水量按每亩50 L。分别于每种蔬菜叶片发育期，进行茎叶喷雾。分别施药2、3次，每次施药间隔期为7天。在最后一次施药后的7、14、21和28 d采集每种蔬菜茎叶样品。试验重复3次。另设清水对照区，施用等量清水，同时采集对照样品。所有样本在采集后2 h内运回实验室，并立即制成实验室样品-20 ℃冷冻保存。
1.3 测定方法
1.3.1样品提取及净化
提取：分别称取不同时期不同蔬菜的样品于高速组织捣碎机中捣碎，分别称取10 g研磨后样品置于50 mL离心管中，加入10 mL乙腈，振荡提取3 min，加入硫酸镁分散于样品中至不结块，样品成糊状。将离心管以4000 r/min离心5 min，使有机溶剂与样品分离。
净化：取上清液1.5 mL于2 mL离心管中(2 mL离心管要预先加入150 mg无水硫酸镁和50 mg PSA吸附剂)，涡旋振荡仪振荡3 min，再以12 000 r/min离心3 min。
检测样品的制备：用一次性注射器吸取净化后的上清液1 mL，过0.22 μm滤膜，注入2 mL样品瓶内，进液相色谱测定。
1.3.2液相色谱仪检测条件
色谱柱：ZORBAX 300SB-C18 250 mm×4.6 mm(5.0 μm)；
柱温30 ℃；
流动相：甲醇-水(80∶20)；
流速1.0 mL/min；
检测波长：278 nm；
进样量20 μL；
相对保留时间2.00 min。
1.3.3标准溶液配制和标准曲线绘制
准确称取0.01 g吡唑醚菌酯标准品，用甲醇溶解定容至50 mL，配制成200 mg/L的标准储备液，于4 ℃下避光保存。根据需要，用50%的甲醇逐渐稀释成100、50、25、6.25、0.625 mg/L的标准溶液，按1.3.2条件检测，以标准品的进样质量浓度(mg/L)为横坐标，对应的峰面积为纵坐标，绘制标准曲线。
1.3.4计算1.3.4.1样品中吡唑醚菌酯含量的计算方法
式中Xs为样品中吡唑醚菌酯的残留量，单位mg/kg。
Cs为把样品峰面积代入标准曲线中计算得到的浓度，单位mg/L。
VAC为提取时加入乙腈的体积，单位mL。
m为提取时所称量样品的质量，单位g。
以采样时间为横坐标，残留量为纵坐标，绘制散点图，用下面的一级动力学方程拟合出参数k和x，利用参数k计算半衰期。
一级动力学方程：y=xe-kt
半衰期：T1/2=ln2/k
式中：y为时间t时农药的残留量(mg/kg)，x为农药的初始质量分数(mg/kg)，k为降解速率常数，t为降解时间(d)。
1.4 添加回收率与相对标准偏差分析
分别在空白基质中添加0.05、0.2、1.0 mg/kg 3个水平的吡唑醚菌酯标准溶液，每个水平重复3次，按1.3.1和1.3.2测定回收率，并计算其相对标准偏差(RSD)。
2.1 分析方法的灵敏度和线性范围
精准称取吡唑醚菌酯的标准样品0.01 g(精确至0.0001g)，用甲醇溶解并定容至50 mL，配成200 mg/L的标准储备液待用。根据需要，用50%的甲醇溶液稀释成100、50、25、6.25、0.625 mg/L的标准工作溶液于4 ℃保存。以标准品的进样质量浓度(mg/L)为横坐标，对应的峰面积为纵坐标，绘制标准曲线(图1)。吡唑醚菌酯在蔬菜样品中的最低定量限(LOQ)为0.27 mg/kg，以3倍信噪比(S/N)计算得吡唑醚菌酯在蔬菜样品中的检出限(LOD)为0.15 mg/kg。吡唑醚菌酯的回归方程为：y=77.19x+3.87，R2=0.99997，在0.625～100 mg/L范围内溶液浓度与峰面积的灵敏度及线性关系良好(图1)。
图1 吡唑醚菌酯液相色谱图(a)及标准曲线(b)Fig.1 Chromatogram(a) and standard curve(b) of pyraclostrobin
2.2 分析方法的准确度和精密度
在0.05～1.00 mg/kg的添加水平下，吡唑醚菌酯在香菜、韭菜、白菜、奶油生菜、萝卜菜、黄心乌白菜、奶油小白菜7种蔬菜中的平均添加回收率均在89.7%～103.4%之间，相对标准偏差RSD值在添加回收率和相对标准偏差皆符合农药残留试验要求(表1)。
表1 吡唑醚菌酯的添加回收率表Tab.1 Fortified recovery of pyraclostrobin
2.3 25%吡唑醚菌酯悬浮剂在7种蔬菜中的消解动态
25%吡唑醚菌酯悬浮剂在7种蔬菜中的消解动力学方程见表2和图2。结果表明，25%吡唑醚菌酯悬浮剂在7种蔬菜中的原始沉积量分别为9.25、6.40、12.82、5.59、7.99、12.45、11、52 mg/kg；
用一级动力学方程拟合吡唑醚菌酯在香菜、韭菜、白菜、奶油生菜、萝卜菜、黄心乌白菜、奶油小白菜中的消解动态方程如表2所示。吡唑醚菌酯在7种蔬菜中的半衰期为1.36～6.93 d，属于易降解农药。表明吡唑醚菌酯在不同蔬菜中的消解速率有一定差异，其中在白菜中的消解率最快，而在奶油生菜中的消解率最慢。
表2 吡唑醚菌酯在7种蔬菜中的消解动态Tab.2 Dissipation of pyraclostrobin in seven vegetables
图2 吡唑醚菌酯在7种蔬菜中的消解动态曲线Fig.2 Degradation curve of pyraclostrobin in seven vegetables
2.4 25%吡唑醚菌酯悬浮剂在7种蔬菜中的最终残留
25%吡唑醚菌酯悬浮剂在7种蔬菜中的最终残留如表3所示，采集末次施药后7、14、21、28 d的7种蔬菜作为最终残留试验检测样品，测定7种蔬菜中农药残留量。结果显示，施药量为30或45 mL/667 m2，施药2～3次，施药后14～28 d，所有蔬菜样品中吡唑醚菌酯均符合安全要求(低于5 mg/kg)。
表3 吡唑醚菌酯在7种蔬菜中的最终残留Tab.3 Terminal residues of pyraclostrobin in seven vegetables
30 mL/667 m2(制剂用量)喷施茎叶，施药2～3次，距离末次施药后7 d，黄心乌白菜、奶油小白菜、香菜、白菜和奶油生菜样品中吡唑醚菌酯残留量为1.14～4.84 mg/kg，均低于我国规定吡唑醚菌酯在蔬菜中的最高残留量(MRL)5 mg/kg，而韭菜和萝卜菜样品中吡唑醚菌酯残留量为4.12～6.20 mg/kg，高于安全要求。距离末次施药后14～28 d，7种蔬菜中吡唑醚菌酯残留量为0.00～3.89 mg/kg，均低于规定的MRL值，符合安全要求；
尤其28 d后奶油小白菜中未检出吡唑醚菌酯。
45 mL/667 m2(制剂用量)喷施茎叶，施药2～3次，距离末次施药后7 d，黄心乌白菜和奶油小白菜中吡唑醚菌酯残留量为1.13～2.44 mg/kg，未超安全限量；
而白菜、韭菜、奶油生菜、香菜和萝卜菜中吡唑醚菌酯残留量为1.98～10.78 mg/kg，部分超过残留限量。距离末次施药14～28 d后，7种蔬菜中吡唑醚菌酯残留量为0.00～4.95 mg/kg，均低于吡唑醚菌酯在蔬菜上的最大残留限量，且28 d后奶油小白菜中仍未检出吡唑醚菌酯。
本研究建立了高效液相色谱法测定吡唑醚菌酯残留的分析方法，明确了其在7种蔬菜中的消解动态及最终残留量。该方法灵敏度好，准确度和精密度均符合农药残留分析标准要求。消解动态试验结果表明，吡唑醚菌酯在7种蔬菜中的残留消解动态均符合一级动力学方程。田间施药后，吡唑醚菌酯在7种蔬菜中的降解半衰期有一定差异，其在奶油生菜中的降解半衰期为6.93 d，而在白菜中的降解半衰期为1.36 d。降解速率快，属易降解农药。
本研究中测定的吡唑醚菌酯在白菜中的降解半衰期为1.36 d，这与张少军等[21]测定吡唑醚菌酯在大白菜(河北试验点，半衰期为2.97 d；
湖北试验点，半衰期为3.34 d)中的消解动态试验结果，以及余维维等[23]测定吡唑醚菌酯在黄瓜(广西试验点，半衰期为2.08 d)中的消解动态试验结果具有一定差异，可能是由作物自身、土壤、地理条件、气候以及人为因素等所导致的差异。最终残留试验结果表明，距末次施药14～28 d，残留量均小于我国规定的吡唑醚菌酯MRL值(0.5 mg/kg)，表明吡唑醚菌酯在7种蔬菜中的残留风险较低。
本文通过研究吡唑醚菌酯在7种蔬菜中的消解动态及最终残留量，为评估吡唑醚菌酯在蔬菜中的膳食风险提供相关科学依据[29]。同时，吡唑醚菌酯在除白菜外的许多常见蔬菜中的MRL值并未有明确的制定，本研究也为7种蔬菜中吡唑醚菌酯MRL值的制定提供参考依据。
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